一步法640 TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒(遠(yuǎn)紅)

產(chǎn)品描述

細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí), 會(huì)激活一些DNA內(nèi)切酶，這些內(nèi)切酶會(huì)切斷核小體間的基因組DNA，產(chǎn)生180bp-200bp的DNA片段，表現(xiàn)為瓊脂糖凝膠電泳中呈現(xiàn)的特異的梯狀Ladder圖譜。基因組DNA雙鏈或單鏈斷裂時(shí)會(huì)出現(xiàn)產(chǎn)生大量的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的催化作用下，與dUTP結(jié)合，從而通過熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀直接進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（Terminal - deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3'-OH形成，很少能夠被染色。Tunel法可以對(duì)完整的單個(gè)凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色，能準(zhǔn)確地反應(yīng)細(xì)胞凋亡典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征，可檢測出極少量的凋亡細(xì)胞，因而在細(xì)胞凋亡的研究中廣泛采用。

本試劑盒應(yīng)用范圍廣，可用于檢測冷凍或石蠟切片中的細(xì)胞凋亡情況，也可檢測培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞或懸浮細(xì)胞的凋亡情況。可選擇性的檢測凋亡細(xì)胞，而非壞死細(xì)胞或因輻照和藥物治療而造成的DNA鏈斷裂的細(xì)胞。本試劑盒檢測細(xì)胞凋亡，耗時(shí)短，只需一步染色反應(yīng)，洗滌后即可檢測。

訂購信息

產(chǎn)品組分

運(yùn)輸與保存

藍(lán)冰運(yùn)輸。-20℃保存，有效期24個(gè)月。【注】：組分A需避光保存，避免反復(fù)凍融。

產(chǎn)品參數(shù)

實(shí)驗(yàn)材料（自備）

使用方法

一、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

A.      陽性對(duì)照：DNase I處理制備陽性對(duì)照載玻片。DNase I可以消化單鏈或雙鏈DNA暴露3'-OH末端，人為造成細(xì)胞凋亡。每次實(shí)驗(yàn)做一次即可（用來驗(yàn)證本次實(shí)驗(yàn)操作和試劑盒有無問題）。

B.      陰性對(duì)照：使用不含TdT Enzyme的TUNEL Reaction Buffer，用ddH₂O替代TdT Enzyme（主要是排除細(xì)胞自身凋亡、操作過程等原因?qū)е碌姆翘禺愋匀旧约罢{(diào)整拍攝曝光強(qiáng)度）。

C.      實(shí)驗(yàn)處理組：實(shí)驗(yàn)組按照說明書正常操作。

D.      實(shí)驗(yàn)對(duì)照組：實(shí)驗(yàn)組按照說明書正常操作。

二、實(shí)驗(yàn)步驟

1. 樣本準(zhǔn)備：

(1)   對(duì)于貼壁細(xì)胞或細(xì)胞涂片

a.      PBS清洗1次。【注】：如果擔(dān)心細(xì)胞涂片的細(xì)胞貼得不牢，可以干燥樣品使細(xì)胞貼得更牢。

b.      固定：加入適量4%多**醛（PBS配制），4℃固定30 min。PBS清洗2次。

c.       通透：加入適量0.4% Triton X-100（PBS配制），室溫通透20 min。PBS清洗2次。

d.      轉(zhuǎn)步驟2. TUNEL 反應(yīng)。

(2)   對(duì)于懸浮細(xì)胞或細(xì)胞懸液

a.      收集細(xì)胞（ 3-5×10⁶個(gè)細(xì)胞），1000 rpm離心5 min，PBS清洗2次。

b.      固定: 加入適量4%多**醛 (PBS配制) 充分重懸細(xì)胞，4℃固定30min。2000rpm離心5min，PBS清洗2次。

c.       通透: 加入適量0.4% Triton X-100 (PBS配制)，室溫通透20min。2000rpm離心5min，PBS清洗2次。

d.      轉(zhuǎn)步驟2. TUNEL 反應(yīng)。

(3)   石蠟組織切片

a.      將石蠟切片置于切片架上，放置于60℃烘箱中烤片60min。

b.      脫蠟與水化: 將切片樣本依次放入二甲苯I (10min) → 二甲苯II (10min) → 100％乙醇I (5min) → 100％乙醇II (5min) → 95%乙醇 (5min) → 90%乙醇 (5min) → 80%乙醇 (5min) → 70%乙醇 (5min) → ddH₂O沖洗5min，沖洗2次。【注】：二甲苯有毒，易揮發(fā)，請?jiān)谕L(fēng)櫥中進(jìn)行此操作。

c.       用濾紙吸干切片樣本周圍液體，用免疫組化筆圈好樣本輪廓，以便下游通透與標(biāo)記。【注】：若在后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作中發(fā)現(xiàn)免疫組化筆畫的輪廓圈被破壞，需及時(shí)補(bǔ)畫。

d.      通透：按1:50的比例，將2 mg/mL的Proteinase K溶液用PBS稀釋至終濃度40 µg/mL，在每個(gè)樣本上滴加100 µL，使溶液覆蓋全部樣本區(qū)域，37℃孵育30 min。【注】：Proteinase K可通透細(xì)胞膜和核膜，從而使后續(xù)步驟的染色試劑充分進(jìn)入細(xì)胞核進(jìn)行反應(yīng)，提高標(biāo)記效率。孵育時(shí)間過長會(huì)增加組織切片在后續(xù)洗滌步驟中從載波片上脫落的風(fēng)險(xiǎn)，過短則可能造成透性處理不充分，影響標(biāo)記效率。為得到更好的結(jié)果，Proteinase K的濃度、孵育時(shí)間、溫度需根據(jù)不同類型組織樣本進(jìn)行優(yōu)化。

e.      將切片樣本浸入 1×PBS 漂洗三次，每次5min，用濾紙吸去多余的液體，將處理好的樣本放在濕盒中保持濕潤。【注】：這一步必須把Proteinase K洗滌干凈，否則會(huì)嚴(yán)重干擾后續(xù)的標(biāo)記反應(yīng)。

f.        轉(zhuǎn)步驟2. TUNEL 反應(yīng)。

(4)   冰凍組織切片

a.      固定：取出冰凍切片，并回溫至室溫。將切片樣本浸入4%多**醛（PBS配制）中，室溫固定30min。將切片樣本浸入 1×PBS 漂洗三次，每次10min。【注】：若是擔(dān)心甲醛清洗不干凈，影響最終染色效果。可在甲醛固定完成后加入適量2 mg/mL 甘氨酸清洗 10 min，中和殘留的固定液，再進(jìn)行PBS清洗。

b.      用濾紙吸干切片樣本周圍液體，用免疫組化筆圈好樣本輪廓，以便下游通透與標(biāo)記。【注】：若在后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作中發(fā)現(xiàn)免疫組化筆畫的輪廓圈被破壞，需及時(shí)補(bǔ)畫。

c.       通透：按1:50的比例，將2 mg/mL的Proteinase K溶液用PBS稀釋至終濃度40 µg/mL，在每個(gè)樣本上滴加100 µL，使溶液覆蓋全部樣本區(qū)域，37℃孵育20 min。【注】：Proteinase K可通透細(xì)胞膜和核膜，從而使后續(xù)步驟的染色試劑充分進(jìn)入細(xì)胞核進(jìn)行反應(yīng)，提高標(biāo)記效率。孵育時(shí)間過長會(huì)增加組織切片在后續(xù)洗滌步驟中從載波片上脫落的風(fēng)險(xiǎn)，過短則可能造成透性處理不充分，影響標(biāo)記效率。為得到更好的結(jié)果，Proteinase K的濃度、孵育時(shí)間、溫度需根據(jù)不同類型組織樣本進(jìn)行優(yōu)化。如優(yōu)化Proteinase K的濃度與孵育時(shí)間仍無法改善染色效果，可選擇將樣本浸入1%Triton X-100（PBS配制）中，室溫促滲3-5min；之后將切片樣本浸入1×PBS漂洗三次，每次5min。

d.      將切片樣本浸入1×PBS漂洗三次，每次5min，用濾紙吸去多余的液體，將處理好的樣本放在濕盒中保持濕潤。【注】：這一步必須把Proteinase K洗滌干凈，否則會(huì)嚴(yán)重干擾后續(xù)的標(biāo)記反應(yīng)。

e.      轉(zhuǎn)步驟2. TUNEL 反應(yīng)。

(5)   陽性處理（僅陽性對(duì)照進(jìn)行此步驟，其他樣品直接進(jìn)行TUNEL反應(yīng)步驟）

a.      按1:10的比例用ddH₂O將10× DNase I Buffer稀釋成1× DNase I Buffer備用。

b.      滴加100 µL 1× DNase I Buffer到已處理的樣本上，覆蓋全部樣本區(qū)域，室溫平衡5min。

c.       用1× DNase I Buffer以1: 100稀釋DNase I (2 U/μL)至終濃度20 U/mL的工作液。

d.      棄去Buffer，加入100 μL濃度為20 U/mL的 DNase I工作液，室溫孵育15min。

e.      棄去DNase I工作液，PBS清洗2次。

f.        轉(zhuǎn)步驟2. TUNEL 反應(yīng)。

2. TUNEL 反應(yīng)

(1)   配制TUNEL反應(yīng)液（即用即配）：

(2)   對(duì)于貼壁細(xì)胞、細(xì)胞涂片或組織切片

a.      每個(gè)樣本加入50 μL TUNEL反應(yīng)液，使反應(yīng)液均勻覆蓋樣本。37℃避光孵育適宜的時(shí)間（細(xì)胞推薦染色時(shí)間15min-30h，組織染色時(shí)間推薦1h）。【注】：50μL TUNEL反應(yīng)液適合涂片、切片或96孔板（其他不同孔板可以適當(dāng)調(diào)整TUNEL反應(yīng)液體積，覆蓋細(xì)胞即可）。如果待檢測的樣品為涂片、切片或在24孔板、12孔板或6孔板中，可以使用防蒸發(fā)膜，或自行嘗試使用自封袋或者其它適當(dāng)材料自行裁剪成比孔略小的圓形塑料片，滴加TUNEL反應(yīng)液后覆蓋在樣品上，可以防止TUNEL反應(yīng)液蒸發(fā)，并且使TUNEL反應(yīng)液均勻覆蓋樣本。

b.      棄去TUNEL反應(yīng)液，PBS清洗2次后，再用0.1% Triton X-100（PBS配制，其中含5mg/mL BSA）清洗3次，每次5min，這樣游離的未反應(yīng)的標(biāo)記物可以清除較干凈。

c.       （可選）每個(gè)樣本加入適量濃度為5 μg/mL的DAPI染液，室溫避光孵育5min。染色完成后，棄去DAPI染液，PBS清洗2次，每次5min。

d.      （可選）切片封片：每個(gè)樣本滴加20 μL抗熒光淬滅封片劑 (貨號(hào)：AC28L532) ，抗熒光淬滅封片劑可能會(huì)不適用于某些染料，實(shí)驗(yàn)前建議進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)測試匹配性），蓋上蓋玻片，用鑷子的鈍端輕輕敲擊蓋玻片，去除氣泡以使封片*全。

e.      用濾紙吸去多余的液體，向樣本區(qū)域加100μL PBS保持樣本濕潤，立即在熒光顯微鏡下觀察。

(3)   對(duì)于懸浮細(xì)胞或細(xì)胞懸液

a.      每個(gè)樣本管加入50 μL TUNEL反應(yīng)液輕輕重懸細(xì)胞，37℃避光孵育15-30min。每隔10min用微量移液器輕輕重懸細(xì)胞。

b.      2000rpm離心5min，棄去TUNEL反應(yīng)液，加入適量0.1% Triton X-100（PBS配制，其中含5mg/mL BSA）清洗2次，每次5min，這樣游離的未反應(yīng)的標(biāo)記物可以清除較干凈。

c.       每個(gè)樣本管加入100μL濃度為5μg/mL的DAPI染液，室溫避光孵育5min。

d.      加入400μL PBS重懸細(xì)胞，立即用流式細(xì)胞儀檢測或進(jìn)行涂片后在熒光顯微鏡下觀察。

注意事項(xiàng)

1. 本產(chǎn)品僅限于科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領(lǐng)域。

2. 使用前請將產(chǎn)品瞬時(shí)離心至管底，再進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3. 染色背景較重或非特異性著色明顯時(shí)可適當(dāng)減少染色時(shí)間。

4. 實(shí)驗(yàn)時(shí)建議增加陰性對(duì)照和陽性對(duì)照組。

5. 組分A使用時(shí)請佩戴口罩、手套，如接觸皮膚，請立即用大量水沖洗。

6. 熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

7. 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

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