RIPA裂解液  (強)

產(chǎn)品描述

RIPA (Radio Immunoprecipitation Assay)裂解液，是一種經(jīng)典的動物組織/細胞快速裂解液，通過組合離子型去垢劑和非離子去污劑對組織細胞的消化作用使組織細胞崩解釋放出蛋白質(zhì)，對細胞膜、胞漿亞組分、胞核成分均有較強裂解作用。適用于PAGE、Western Blotting和免疫沉淀(IP)的研究。

李記生物RIPA裂解液 (強) 不含PMSF組分；適用PAGE、Western Blotting和免疫沉淀(IP)的研究。

訂購信息

運輸與保存

常溫運輸。4℃保存，有效期12個月。

配方表

25mM Tris•HCl，150mM NaCl，1% NP-40，1% sodium deoxycholate，0.1% SDS，pH 7.6

使用方法

貼壁細胞

1.      取適量裂解液，加入蛋白酶抑制劑混合物(100×，不含EDTA) （貨號:AP02L084） 或PMSF（終濃度為 1 mM，但PMSF不足以抑制所有蛋白酶活性）。

2.      去除細胞培養(yǎng)液，用預冷的 PBS 洗滌兩次。按照6孔板每孔加入150-200ul 的裂解液的比例均勻加入裂解液，如果細胞密度過高可增加裂解液的量至250-300 uL。【注】：裂解液過少會使細胞裂解不充分，影響蛋白提取的質(zhì)量。

3.      用槍吹打數(shù)下，冰上放置10 min，期間每隔2 min用槍吹打數(shù)下。

4.      轉(zhuǎn)移細胞裂解液于1.5 mL EP管中。

5.      12,000 g，4℃ 離心5min。

6.      收集上清。

懸浮細胞

1.      取適量裂解液，加入蛋白酶抑制劑混合物(100×，不含EDTA) （貨號:AP02L084） 或PMSF(終濃度為 1 mM，但PMSF不足以抑制所有蛋白酶活性）。

2.      收集細胞0.5~2x10⁷于1.5mL離心管中，1mL預冷的PBS洗滌兩次，1,000xg 離心3 min，棄上清，重復三次。

3.      按照6孔板每孔加入150-200uL 的裂解液的比例均勻加入裂解液，如果細胞密度過高可增加裂解液的量至250-300uL。【注】：裂解液過少會使細胞裂解不充分，影響蛋白提取的質(zhì)量。

4.      用槍吹打數(shù)下并劇烈震蕩，冰上放置10 min，期間每隔2 min震蕩一次。

5.      12,000 g，4℃ 離心5 min。

6.      收集上清。

組織樣品

1.      把組織剪成細小的碎片。

2.      取適量裂解液，加入蛋白酶抑制劑混合物(100×，不含EDTA) （貨號:AP02L084） 或PMSF(終濃度為 1 mM，但PMSF不足以抑制所有蛋白酶活性）。

3.      按照每100mg組織加入1mL裂解液的比例加入裂解液（如裂解不充分可適當增加裂解液，如果需要增加蛋白濃度可適當減少使用的裂解液體積）。

4.      用勻漿器勻漿，直至充分裂解（為防止蛋白降解請于冰上操作）。

5.      12,000 g，4℃ 離心5 min。

6.      收集上清。

注意事項

1.         本產(chǎn)品僅限于科學實驗研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領域。

2.         如需檢測磷酸化蛋白，則需要額外添加磷酸酶抑制劑II cocktail（50×）(貨號:AP03L025) 。

3.         RIPA裂解液的裂解產(chǎn)物中經(jīng)常會出現(xiàn)一小團透明膠狀物，屬正常現(xiàn)象。該透明膠狀物為含有基因組DNA等的復合物。在不檢測基因組DNA結(jié)合特別緊密的蛋白的情況下，可以直接離心取上清用于后續(xù)實驗；如果需要檢測和基因組結(jié)合特別緊密的蛋白，則可以通過超聲處理打碎打散該透明膠狀物，隨后離心取上清用于后續(xù)實驗。如果檢測一些常見的轉(zhuǎn)錄因子，例如NF-kappaB、p53等時，通常不必進行超聲處理，就可以檢測到這些轉(zhuǎn)錄因子。

4.         RIPA裂解液（強）含有較高濃度的去垢劑，不能用Bradford法測定蛋白。

5.         如果組織樣品本身非常細小，可以適當剪切后直接加入裂解液裂解，通過強烈vortex使樣品裂解充分。然后同樣離心取上清，用于后續(xù)實驗。直接裂解的優(yōu)點是比較方便，不必使用勻漿器，缺點是不如使用勻漿器那樣裂解得比較充分。

6.         通常6孔板每孔細胞加入150 μL裂解液已經(jīng)足夠，但如果細胞密度非常高可以適當加大裂解液的用量到200 μL或250 μL。

表1: RIPA裂解液的使用量

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蛋白酶抑制劑混合物(100×，不含EDTA)（貨號：AP02L084）