瓊脂糖凝膠與核酸電泳小知識(shí)分享

　　影響核酸電泳遷移率的幾個(gè)因素
 

　　1、核酸分子大小
 

　　在一定濃度的瓊脂糖凝膠中，DNA片段遷移距離和其含有的堿基對(duì)數(shù)量成反比，因此可以通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)條帶遷移距離進(jìn)行比較，由此得出目的條帶的大小，但這僅對(duì)雙鏈線性的DNA比較準(zhǔn)確(DNA Marker一般為雙鏈線狀DNA)，且對(duì)大于20kb的DNA不適用(普通瓊脂糖凝膠很難將其分開(kāi))。
 

　　2、核酸分子構(gòu)象
 

　　DNA分子在電場(chǎng)中的遷移速度不僅和分子量有關(guān)，還和它本身的構(gòu)象有關(guān)。相同分子量的線狀、開(kāi)環(huán)和超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中的移動(dòng)速度不一樣，移動(dòng)速度次序?yàn)椋汗矁r(jià)閉環(huán)DNA>線性DNA>開(kāi)環(huán)DNA。當(dāng)瓊脂糖濃度太大時(shí)，環(huán)狀的DNA一般不能進(jìn)入膠內(nèi)(停留在孔中)。
 

　　3、瓊脂糖濃度
 

　　同樣的線狀DNA分子在不同濃度的瓊脂糖凝膠中的遷移速度不同，DNA電泳遷移率的對(duì)數(shù)和瓊脂糖凝膠濃度呈線性關(guān)系，凝膠濃度的選擇取決于DNA分子的大小。
 

　　瓊脂糖凝膠濃度與線性DNA分辨范圍
 

　　凝膠濃度(%)           線性DNA長(zhǎng)度(bp)
 

　　0.5                           1000~30000
 

　　0.7                           800~12000
 

　　1.0                           500~10000
 

　　1.2                           400~7000
 

　　1.5                           200~3000
 

　　2.0                           50~2000
 

　　4、電源電壓
 

　　在低電壓時(shí)，線狀DNA片段的遷移速率和所加電壓成正比。但電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大于2kb的DNA片段的分離率達(dá)到最大，所使用的電壓不得超過(guò)5V/cm。
 

　　5、電泳方式
 

　　用于分離核酸的瓊脂糖凝膠電泳可分為垂直型及水平型(平板型)。垂直型電泳，一般用聚丙烯酰胺凝膠做為支撐物。水平型電泳時(shí)，凝膠板完全浸泡在電極緩沖液下1-2mm，故又稱為潛水式。目前更多用的是后者，因?yàn)樗颇z和加樣比較方便，電泳槽簡(jiǎn)單，易于制作，又可以根需要制備不同規(guī)格的凝膠板，節(jié)約凝膠，因而較受歡迎。
 

　　6、嵌入染料的存在
 

　　常用的熒光染料EB可以嵌入到堆積的堿基對(duì)之間，使其剛性更強(qiáng)，并使其遷移速率有所下降。
 

　　7、電泳緩沖液的離子強(qiáng)度
 

　　電泳緩沖液的組成和離子強(qiáng)度也能影響DNA的遷移速度。在離子存在很少的情況下(如無(wú)用蒸餾水配制凝膠)，電導(dǎo)率最小，DNA幾乎不移動(dòng)；在高離子強(qiáng)度的緩沖液中(如誤用10×電泳緩沖液)，則電導(dǎo)率很高并產(chǎn)熱明顯，嚴(yán)重時(shí)能引起凝膠融化或DNA變性。