影響重組腸激酶活性的因素有哪些

　　腸激酶(Enterokinase，EK，EC3.4.21.9)是一種異源二聚體形式存在于哺乳動(dòng)物十二指腸內(nèi)的絲氨酸蛋白酶。它能高效專一性的水解工程菌表達(dá)的融合蛋白（識(shí)別位點(diǎn)是Asp-Asp-Asp-Asp-Lys）釋放出目的蛋白，被廣泛用于生物工程制藥的開發(fā)。牛腸激酶由一條結(jié)構(gòu)亞基（重鏈）和一條催化亞基（輕鏈）構(gòu)成，二者以二硫鍵結(jié)合。據(jù)報(bào)道，重組腸激酶輕鏈體外具有全酶的酶切特異性，同時(shí)對(duì)基因工程融合蛋白底物的酶切活性較提純的牛腸激酶明顯增強(qiáng)。天然腸激酶來源有限，且從動(dòng)物組織提取的腸激酶易污染其他蛋白，給實(shí)際應(yīng)用帶來了困難。這就要求用基因工程方法生產(chǎn)高純度的腸激酶。重組腸激酶可以切割含有四個(gè)天冬氨酸的賴氨酸羧基端肽鍵：天冬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-天冬氨酸-賴氨酸（DDDDK）。可以在較寬pH范圍（4.5-9.5）和較寬溫度范圍內(nèi)有效切割融合蛋白。重組腸激酶可去除位于蛋白質(zhì)N-末端的融合蛋白，以除去不需要的融合標(biāo)簽。

　　常見影響腸激酶活性的因素：

　　在＞200mM咪唑，或＞200mMNaCl，或＞5%甘油，酶切效果受影響。可參照以下推薦方法進(jìn)行酶切：

　　1）為獲得理想酶切結(jié)果，請(qǐng)將樣品透析到25mMTris-HCl8.0緩沖液中，再進(jìn)行酶切。

　　2）若不便透析，可將樣品稀釋，咪唑含量在100mM以下，NaCl濃度在50mM以下，甘油濃度小于5%以下進(jìn)行酶切，酶的用量與蛋白的比例不變（即1U酶切500µg蛋白）。

　　3）如果樣品溶液中含有上述成分中的一種或多種，且不便去除，此時(shí)適當(dāng)增加酶量或延長(zhǎng)酶切時(shí)間，也可達(dá)到較好酶切效果。