Pikogreen熒光染料使用方法

更新時(shí)間：2018-05-25

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使用方法

1. PikoGreen工作液的配制

使用前將PikoGreen dsDNA定量試劑回溫至室溫；PikoGreen是以100µL 200×的濃縮液形式保存于無(wú)水DMSO中的（共10管），實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求用1×TE按1:200 的比例稀釋適量定量試劑濃縮液。例如要準(zhǔn)備足夠的操作溶液以2ml檢測(cè)體系測(cè)定20個(gè)樣品，可向19.9mL 1×TE 中加入100μL PikoGreen dsDNA 定量試劑。工作液見光易降解，盡量在配好后幾小時(shí)內(nèi)使用。

2. 配制標(biāo)準(zhǔn)品DNA溶液

1) 用1 X TE溶液溶解dsDNA制備1μg/mL dsDNA 。根據(jù)在1cm 光程長(zhǎng)度的比色杯中A260nm時(shí)的吸光度確定DNA 濃度；相應(yīng)于1μg/mLdsDNA 溶液A260=0.02。標(biāo)準(zhǔn)液常用小牛胸腺DNA制備，PikoGreen 試劑測(cè)定法在通常污染核酸制劑的幾種復(fù)合物存在的條件下仍能保持線性良好，但是，為了得到有效的對(duì)照處理，被用來(lái)做標(biāo)準(zhǔn)曲線的dsDNA 溶液要用和實(shí)驗(yàn)樣品相同的方式來(lái)處理，并且應(yīng)該包含相同的可能存在的污染物。

2) 制備從0.5ng/mL 到500ng/mL（見表1）單重復(fù)8 個(gè)點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。配制一系列的標(biāo)準(zhǔn)DNA 溶液，然后與等體積的PikoGreen 工作液混和，放入1 x 1cm 比色杯中。混合相同體積的1 x TE 和PikoGreen 操作溶液作為空白對(duì)照,避光于室溫下放置2-5 分鐘。

表1: 用1 x 1cm 比色杯時(shí)DNA 標(biāo)準(zhǔn)濃度配制參考

標(biāo)準(zhǔn)DNA 溶液濃度（ng/mL）	標(biāo)準(zhǔn)DNA 溶液體積（mL）	PikoGreen 工作液體積（mL）	標(biāo)準(zhǔn)DNA 終濃度(ng/mL)
1000	1	1	500
200	1	1	100
50	1	1	25
20	1	1	10
5	1	1	2.5
2	1	1	1
1	1	1	0.5
0	1	1	空白

3) 當(dāng)用微量檢測(cè)皿適配器時(shí)，PikoGreen 測(cè)定也可在較低的測(cè)定體積（50μL 到200μL）內(nèi)完成。產(chǎn)生從1ng/mL 到100ng/mL（見表2）的標(biāo)準(zhǔn)曲線，配制一系列的標(biāo)準(zhǔn)DNA 溶液，然后與等體積的PikoGreen 工作液混和，將至少50μL 溶液轉(zhuǎn)移到微量檢測(cè)皿中。確信不要在樣品中引入氣泡，輕輕地彈微量檢測(cè)皿的外部經(jīng)常可以驅(qū)散氣泡。避光于室溫下放置2-5 分鐘。

表2：用微量檢測(cè)皿DNA 標(biāo)準(zhǔn)濃配制參考

標(biāo)準(zhǔn)DNA 溶液濃度（ng/mL）	標(biāo)準(zhǔn)DNA 溶液體積（mL）	PikoGreen 工作液體積（mL）	標(biāo)準(zhǔn)DNA 終濃度(ng/mL)
200	30	30	100
50	30	30	25
20	30	30	10
5	30	30	2.5
2	30	30	1
0	30	30	空白

4) 孵育后用合適的熒光計(jì)測(cè)量樣品熒光值。Ex/Em=480nm/520nm，為了減少光漂白，應(yīng)保持所有樣品的檢測(cè)時(shí)間一致。用熒光值z(mì)ui大的樣品校正儀器。

5) 用檢測(cè)數(shù)據(jù)與DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度做回歸分析，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3. 樣品分析

1) 用1 x TE 稀釋待測(cè)DNA 樣品至需要的體積（1x1cm 比色杯需1.0mL，微量檢測(cè)皿需25-100μL）。對(duì)樣品高度稀釋可以確保任何污染物都被zui大限度地沖淡。然而，也要避免取樣體積太小而無(wú)法吸取的情況。

2) 在每個(gè)樣品中加入等體積PikoGreen 工作液，混合好，將混合物移入合適的比色杯，避光于室溫下放置2-5 分鐘。

3) 檢測(cè)、讀取熒光值，換算樣品中dsDNA濃度。可以對(duì)樣品進(jìn)行不同的稀釋處理重復(fù)測(cè)定以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。